Ph.D. Program in Biomedical Sciences and Oncology

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Attività di ricerca

Progetto di Dottorato:

Inquadramento diagnostico e cure dei pazienti con quadri pediatrici complessi: “Malattie da alterata funzione della proteina GS alfa”

Introduzione

Le proteine G sono una famiglia di proteine eterotrimeriche, costituite cioè da tre subunità (α, β e γ), che trasducono il messaggio di alcuni ormoni proteici (PTH, TSH, FSH/LH, GHRH, ACTH e altri ancora) dalla membrana cellulare al 2° messaggero (cAMP). La subunità alfa (proteina Gsa) rappresenta la subunità attiva delle proteine G, mentre le subunità β e γ servono a conferirne stabilità. L’identificazione di mutazioni nel gene codificante la proteina Gsa (gene GNAS, sul cromosoma 20q31) ha permesso di correlare diverse patologie alla sua alterata funzione.

Mutazioni gain-of-function, sporadiche, a mosaicismo cellulare, che determinano uno stato attivo più a lungo della proteina, sono responsabili di patologie da aumentata funzione della proteina Gsa, caratterizzate da sintomi di iperfunzione endocrina e proliferazione cellulare di quei tessuti bersaglio dell’azione degli ormoni proteici. La patologia classicamente associata ad aumentata funzione della proteina Gsa è la Sindrome di McCune Albright (MAS), descritta per la prima volta nel 1937 e caratterizzata dalla triade chiazze cutanee caffelatte, pubertà precoce periferica e displasia fibrosa ossea. La definizione molecolare e il follow-up dei soggetti con MAS negli anni hanno tuttavia indicato che questa malattia è quanto mai eterogenea, potendo comprendere iperfunzioni di tutti gli ormoni che utilizzano la proteina Gsa nella traduzione del loro messaggio, con conseguente ipertiroidismo, ipersecrezione di GH e prolattina, sindrome di Cushing e altre ancora, con diversa prevalenza e severità.

Mutazioni loss-of-function, ereditate con meccanismo autosomico dominante, sono responsabili di patologie da ridotta funzione della proteina Gsa, riunite nel gruppo eterogeneo dello Pseudoipoparatiroidismo (PHP), caratterizzato da una resistenza ormonale isolata o multipla agli ormoni che utilizzano la proteina Gsa, e un quadro fenotipico particolare noto come Osteodistrofia di Albright (AHO, comprendente bassa statura, obesità, ritardo mentale, ossificazioni sottocutanee e brachidattilia tipica). Classicamente, sulla base di criteri clinici, biochimici e molecolari, si riconoscono diversi sottotipi di PHP (Ia, Ib e Ic). Tuttavia i recenti studi clinico-molecolari indicano l’esistenza di un’ampia sovrapposizione tra i diversi sottotipi, che peraltro sono legati non solo ad alterazioni all’interno del gene, ma anche ad alterazioni epigenetiche a monte di questo; è pertanto necessaria una rivalutazione della classificazione corrente.

Il Gruppo di Studi “Malattie da alterata funzione della proteina GS alfa” all’interno della Società Italiana di Endocrinologia e Diabetologia Pediatrica, dalla sua fondazione nel 1997, ha raccolto un’ampia casistica multicentrica sia di patologie da aumentata che da ridotta funzione della proteina Gs alfa.  Negli anni ha portato avanti progetti di lavoro clinico-molecolari; quelli attuali sono rivolti da un lato al follow-up di queste patologie  rare pediatriche complesse, per approfondire alcuni aspetti clinici non ancora del tutto chiariti, la loro evoluzione nel tempo ed il corretto trattamento, dall’altro a caratterizzare ulteriormente la genetica di queste forme per giungere ad una precisa definizione diagnostica, correlarla con il fenotipo, per individuare il corretto iter diagnostico-assistenziale.

Progetti attualmente in corso

-Valutazione dell’ipersecrezione di GH nella MAS

L’eccesso di GH (GHH) e prolattina è stato valutato in due coorti di pazienti MAS: è stato identificato in 3/34 casi (8.8%) nella coorte italiana, mentre in 28/129 casi (21,7%) nella coorte americana del National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) di Bethesda, diretto dal Dr. M. Collins.  L’87% di essi presenta in associazione un quadro di iperprolattinemia. Il fenotipo MAS con GHH è più severo perchè sempre associato a displasia fibrosa a livello cranio-faciale, espansione della circonferenza cranica ed a una maggior presenza di comorbilità: asimmetria faciale, neuropatia ottica, deficit uditivo (Boyce et al, 2013). Il dolore osseo sembra essere indipendente dal GHH. Ulteriori dati sono necessari per confermare l’efficacia della terapia medica nel prevenire tali comorbilità.

 -Valutazione dell’efficacia e della sicurezza della terapia con letrozolo nella PPP femminile MAS e PPP isolata

A tutt’oggi esiste un unico studio pilota di 36 mesi su 9 pazienti MAS (Feuillan et al, 2007). E’ auspicabile un’analisi retrospettiva e prospettica delle pazienti in trattamento presso il Centro di Riferimento di Endocrinologia Pediatrica Ospedale Infantile Regina Margherita e nei centri di Endocrinologia Pediatrica del  territorio nazionale per verificarne gli effetti e monitorare gli eventuali eventi avversi del letrozolo (è stato segnalato un caso di torsione ovarica).

-Rivalutazione testicolare clinica ed ecografica a distanza di circa 10 anni in maschi con MAS: possibile significato prognostico

Un precedente studio collaborativo nell’ambito dello stesso GdS SIEDP aveva dimostrato che la microlitiasi testicolare (TM) può essere rilevata in un’altra percentuale (62%) di maschi con MAS, e non solo in quelli con un quadro manifestato di pubertà precoce periferica (PPP) (Wasniewska et al, 2004). L’attuale studio propone una rivalutazione trasversale a distanza di 10 anni del quadro ecografico testicolare e clinico-urologico degli stessi pazienti, per stabilire se si siano verificati eventi nuovi che abbiano arricchito la clinica della MAS, per confrontare il nuovo quadro con quello registrato in passato.

 - Analisi genetica dei pazienti con Sindrome di McCune-Albright con COLD MAMA PCR real time

La mutazione responsabile di MAS è una mutazione post-zigotica, responsabile di un mosaicismo cellulare nei vari tessuti. Per ricercarla è necessario utilizzare una metodica sensibile, in grado di rilevare anche piccole percentuali di mutazione, ma anche specifica, che non consideri il DNA normale che è sicuramente presente, anche in percentuali maggiori rispetto al mutato. E’ stata così sviluppata una nuova metodica di analisi che sfrutta contemporaneamente due concetti fondamentali della biologia molecolare: il MAMA e il COLD. Il MAMA (Mismatch artificiale) si basa sull’utilizzo di un primer per la PCR real time che termina con il suo 3’ esattamente sulla mutazione; in esso viene inserito un mismatch artificiale al terz’ultimo nucleotide, per sfavorire l’amplificazione di prodotti aspecifici. Il termine COLD invece definisce una “PCR fredda”, in cui la denaturazione della fase esponenziale dell’amplificazione avviene a una temperatura di 85-88°C (al posto della solita a 94°C), per mantenere i filamenti di DNA non mutato più chiusi, quelli del mutato aperti ed accessibili ai primers.

-Update genetico-clinico sui pazienti con PHP/AHO

La recente revisione della letteratura indica che, se gli studi molecolari sul locus e gene GNAS, volti a caratterizzare con sempre maggior dettaglio il meccanismo eziopatogenetico della malattia, sono cresciuti in maniera esponenziale nell’ultimo decennio, gli studi clinici sono ancora assai scarni. In particolare mancano dati sulla risposta al trattamento con GH e sull’eventualità di continuare il trattamento in età adulta, sull’eziopatogenesi dell’obesità, sull’assetto metabolico e sugli eventuali trattamenti da mettere in atto per ridurre il sovrappeso o le complicanze ad esso legate. Il ritardo mentale è costantemente riferito parte della sindrome, ma mancano a tutt’oggi lavori che, con test oggettivi, indichino la severità di questa disabilità e le sfere delle acquisizioni neuropsicomotorie più coinvolte, come anche la percezione e l’accettazione da parte dei pazienti o dei loro  genitori di questa condizione clinica. Ancora, la prevalenza e l’evoluzione nel tempo di alcune resistenze ormonali storicamente indicate secondarie all’alterata attività della proteina Gs-alfa, quali la calcitonina, non sono state ulteriormente considerate. La prevalenza, l’evoluzione nel tempo e le eventuali opzioni terapeutiche di ciascuna problematica verranno valutate all’interno del Gruppo di Studi.

-Creazione di PDTA per le “Malattie da alterata funzione della proteina GSalfa”

Giungere alla creazione di Percorsi Diagnostici, Terapeutici ed Assistenziali (PDTA), per la MAS e per PHP/AHO, uniformemente adottati a livello nazionale, attraverso un percorso di accreditamento da parte  della Società italiana di Endocrinologia e Diabetologia Pediatrica (SIEDP), nonché da parte delle Associazioni dei Pazienti (EAMAS),  che ne assicuri l’appropriatezza e il rigore scientifico,  basati sui progetti di cui sopra e la revisione critica della letteratura scientifica.

Bibliografia:

1. Optic neuropathy in McCune-Albright syndrome: effects of early diagnosis and treatment of growth hormone excess. Boyce AM, Glover M, Kelly MH, Brillante BA, Butman JA, Fitzgibbon EJ, Brewer CC, Zalewski CK, Cutler Peck CM, Kim HJ, Collins MT. J Clin Endocrinol Metab 2013; 98: E126-34.
2. Letrozole treatment of precocious puberty in girls with the McCune-Albright syndrome: a pilot study. Feuillan P, Calis K, Hill S, Shawker T, Robey PG, Collins MT.  J Clin Endocrinol Metab.  2007; 92: 2100-6.
3. Testicular microlithiasis: an unreported feature of McCune-Albright syndrome in males. Wasniewska M, De Luca F, Bertelloni S, Matarazzo P, Weber G, Crisafulli G, Valenzise M, Lala R. J Pediatr. 2004; 145:670-2.
4. Genetics of McCune-Albright Syndrome. de Sanctis L, Delmastro L, Russo MC, Matarazzo P, Lala R, de Sanctis C. J Pediatr Endocrinol Metab. 2006; 2:577-82.
5. Pseudohypoparathyroidism and GNAS epigenetic defects: clinical evaluation of albright hereditary osteodystrophy and molecular analysis in 40 patients. Mantovani G, de Sanctis L, Barbieri AM, Elli FM, Bollati V, Vaira V, Labarile P, Bondioni S, Peverelli E, Lania AG, Beck-Peccoz P, Spada A. J Clin Endocrinol Metab. 2010; 95:651-8.
6. Genetics and epigenetics of parathyroid hormone resistance. Bastepe M. Endocr Dev. 2013; 24:11-24.
7. Fibrous Dysplasia/McCune-Albright Syndrome. Boyce AM, Collins MT. GeneReviews. Seattle (WA): University of Washington, Seattle. 2015; 26: 1993-2016.